分光光度計的工作原理主要是基于瑯伯-比爾定律，18世紀初，瑯伯在前人的基礎上，進一步研究了物質對光的吸收與物質厚度的關系，并于1760年指出：如果溶液的濃度一定，則光對物質的吸收程度與它通過的溶液厚度成正比，這就是瑯伯定律，其數學表達式為：

A=lgI。/I=K。b

式中，A為吸光度；I。為入射光強度；I為透射光強度；b為液層厚度（即光程）；K。為比例常數。

1852年，比爾研究了各種無機鹽的水溶液對紅光的吸收后指出：光的吸收和光所遇到的吸光度的數量有關；如果吸光物質于不吸光的溶劑中，則吸光度和吸光物質的濃度成正比，這就是比爾定律，其數學表達式為：

A=lgI。/I=K1C

式中，A為吸光度；I。為入射光強度；I為透射光強度；C為溶液的濃度；K1為比例常數。

將瑯伯定律和比爾定律結合起來，則為瑯伯-比爾定律，公式如下：

A=lgI。/I=K2bC

式中，A為吸光度；I。為入射光強度；I為透射光強度；C為溶液的濃度；b為液層厚度（即光程）；K1為比例常數。

比爾定律認為：當一束光平行的單色光通過某一均勻的有色溶液時，溶液的吸光度與溶液的濃度和光程的乘積成正比，這就是瑯伯-比爾定律的真正物理意義，它是光度分析中定量分析的zui基礎、zui根本的依據，也是紫外可見分光光度計的基本原理。